磷酸化蛋白Western Blot的注意事項(xiàng)

• 關(guān)于/磷酸化蛋白樣品，裂解液?jiǎn)栴}

• 蛋白的磷酸化是一個(gè)非常迅速的反應(yīng)，所以取樣品的過(guò)程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理*好在冰上操作，操作時(shí)間盡量短。用PBS洗滌細(xì)胞時(shí)，PBS一定要4℃預(yù)冷。如果是組織的話(huà)，提取蛋白時(shí)采用液氮研磨的方法，研磨器具*好提前預(yù)冷，保持低溫的狀態(tài)。
• 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測(cè)的蛋白磷酸化位點(diǎn)是什么氨基酸，如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉，上樣前不要煮沸，煮沸可能會(huì)破壞其磷酸化位點(diǎn)。
• 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存，*好是收集完成后馬上變性并于-80℃分裝保存，以保證降解程度*小。同時(shí)避免反復(fù)凍溶導(dǎo)致磷酸基團(tuán)的降解。
• 關(guān)于/Western Blot操作問(wèn)題
• 磷酸化蛋白的表達(dá)豐度較低，一般只有總蛋白量的10%，甚至更低，一定要確保每個(gè)凝膠孔中有足夠的目的蛋白上樣量。
• 磷酸化蛋白容易脫磷酸化，除提取蛋白時(shí)要迅速小心外，也可在上樣緩沖液和轉(zhuǎn)移緩沖液中加入磷酸化酶抑制劑Na3VO4等。
• 磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。好抗體，傻瓜也能做出來(lái)，不好的抗體神仙也無(wú)辦法。有些公司的抗體很好，有些公司的抗體很差（一些大公司同樣會(huì)有低劣產(chǎn)品），而且這一點(diǎn)對(duì)非磷酸化的抗原檢測(cè)也很重要。
• 因?yàn)榱姿峄鞍字徽伎偟鞍琢康臉O少部分，加入一抗后*好4℃過(guò)夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。4℃也可以使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化抗體都挺貴的。二抗則室溫1h即可。4℃過(guò)夜，主要原因不是使抗體結(jié)合更好，而是蛋白抗原不容易從膜上脫落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附屬熱力學(xué)范疇，高溫下容易脫落。而抗體-抗原結(jié)合是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)問(wèn)題，高溫容易結(jié)合是熱力學(xué)范疇，抗體、抗原濃度卻是動(dòng)力學(xué)范疇。膜上的抗原脫落了，結(jié)合效率會(huì)低。
• 磷酸化蛋白WB時(shí)，用洗滌液漂洗時(shí)也要注意一下，搖床的轉(zhuǎn)速不要太快，洗的時(shí)間不要太長(zhǎng)，孵育一抗和二抗之后分別洗3次，每次5min即可。寧愿深一些，總比做不出來(lái)強(qiáng)得多。另外，洗的時(shí)候，*好不要把幾張膜疊在一起洗。
• 關(guān)于/磷酸化抗體的說(shuō)明書(shū)
• 磷酸化抗體的說(shuō)明書(shū)大家一定要仔細(xì)看，并*好根據(jù)廠商的操作說(shuō)明來(lái)操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。因?yàn)椴煌牧姿峄贵w公司推薦的操作步驟不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脫脂奶粉封閉，一抗、二抗也需要脫脂奶粉配制；而CST的一些抗體則是脫脂奶粉封閉，一抗、二抗用BSA配制。其中原因不詳，但是應(yīng)該是非常關(guān)鍵的，我試過(guò)用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的條帶非常淡。
• 關(guān)于/WB時(shí)背景和條帶的問(wèn)題
• 磷酸化蛋白WB時(shí)背景也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當(dāng)，不能太長(zhǎng)或過(guò)短，太長(zhǎng)則背景太深蓋住想要的那條帶，時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有條帶或者條帶太淺。
• 洗滌液對(duì)*后的背景影響也較大，密理博（millipore）*近的說(shuō)明書(shū)推薦用雙蒸水洗滌，我對(duì)比了TBST洗滌的膜，效果有一定差距，背景有效降低，即便壓片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，雙蒸水充分減少了ECL反映中其他緩沖液的影響，應(yīng)該是可取的。
• 做磷酸化蛋白WB時(shí)，除了目標(biāo)蛋白的條帶以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話(huà)，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘臈l帶，反而沒(méi)有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據(jù)Markers比對(duì)一下你壓出的條帶分子量是否正確。
• 關(guān)于/蛋白總的表達(dá)量問(wèn)題
• 研究完某一蛋白的磷酸化情況后*好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)膠，壓內(nèi)標(biāo)。但是一般不建議如此做，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較公認(rèn)的，也是常用的方法，即用strip液將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內(nèi)標(biāo)。
• 關(guān)于/Strip時(shí)的問(wèn)題
• Strip時(shí)一定要注意，膜一定要完全泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受熱均勻。這一點(diǎn)很重要，要不然，隨后壓出來(lái)的總蛋白也好，內(nèi)標(biāo)也好就會(huì)不均一，無(wú)法進(jìn)行比較。
• strip液是用來(lái)去除已結(jié)合的抗體，但也會(huì)去除部分的蛋白，導(dǎo)致蛋白信號(hào)變?nèi)?。?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴有時(shí)溫度不穩(wěn)定，溫度定為55℃時(shí)往往其溫度容易超過(guò)，導(dǎo)致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設(shè)為50℃，30min，既能有效去除已結(jié)合的抗體，又比55℃更能保護(hù)蛋白。